青海省人民医院  陈健  吴世政 张淑坤
【摘要】目的 研究不同海拔高度和造模后不同时间点脑梗死大鼠脑组织中ASPP1、VEGF免疫組化的表达情况，评估在低压缺氧预处理后脑梗死大鼠的脑储备能力，探讨高原地区缺血性脑血管病脑储备能力的特点。方法 采用免疫组化方法检测脑梗死大鼠脑组织中ASPP1、VEGF表达情况，根据染色深浅和阳性细胞比率评分，进行统计学分析，比较不同海拔高度和造模后不同时间点的差异。结果ASPP1在脑梗死后1d和3d、7d、14d, 3d和7d、14d, 7d和14d比较以及海拔2200m和3500m, 3500m和4500m比较P值＜0.05，具有显著性差异。VEGF在脑梗死后1d和3d、7d、14d,  3d和7d，7d和14d,比较以及海拔2200m和3500m 、4500m, 3500m和4500m比较P值＜0.05，具有显著性差异。结论 在中度海拔和高海拔地区适度低氧可以对抗细胞凋亡，在特高海拔和极高海拔地区能诱导细胞凋亡；在不同海拔高度低压缺氧预处理可以提高机体VEGF的表达水平，增强脑结构储备和脑代谢储备能力。
【关键词】凋亡刺激蛋白1；血管内皮生长因子；脑储备能力



Study on ASPP1、VEGF of cerebral infarction rat brain at different altitude and the relationship between cerebral reserve capacity and ASPP1、VEGF

【Abstract】Objective  To study the expression of ASPP1、VEGF at different altitude and different times in cerebral infarction rat brain. To evaluate cerebral reserve capacity after hypoxia preconditioning.To discuss characteristic of cerebral reserve capacity of ischemic cerebrovascular disease at high altitude.Methods  Expression of ASPP1、VEGF at different altitude and different times in cerebral infarction rat brain were tested by immunohistochemistry technic.The score were counted according to colouration degree and positive cells amount, which were treated with statistics. The difference at different altitude and different times in cerebral infarction rat brain were compared.Results  Expression of ASPP1 of 1d and 3d、7d、14d, 3d and 7d、14d, 7d and 14d after cerebral infarction and altitude 2200m and 3500m,  3500m and4500m were in significance(P＜0.05). Expression of VEGF 1d and 3d、7d、14d,  3d and 7d，7d and 14d after cerebral infarction and altitude 2200m and 3500m 、4500m, 3500m and 4500m were in significance(P＜0.05).Conclusion  Apoptosis were decreased by hypoxia at moderate altitude and high altitude , were increased by hypoxia at very high altitude and extreme altitude. Expression of VEGF after hypoxia preconditioning at different altitude were increased, and cerebral structure reserve and metabolism reserve were strengthened.
【Key Words】  ASPP1(apoptosis stimulating protein 1 of p53); VEGF(vascular endothelial growth factor); CRC（cerebral reserve capacity）
ASPP (p53凋亡刺激蛋白，apoptosis stimulating protein of p53)是2001年发现的一个蛋白质家族，该家族成员包括ASPP1、ASPP2和iASPP (inhibitory member of the ASPP family)3个成员， ASPP1及ASPP2能够和p53结合共同调节p53蛋白的生物学活性，促进DNA损伤的细胞发生凋亡。完整的iASPP是由828个氨基酸残基组成。 iASPP可竞争性的和ASPP1、ASPP2与p53结合，抑制p53的促细胞凋亡活性。
VEGF（血管内皮生长因子，vascular endothelial growth factor ）是一类普遍存在于中枢神经系统的生长因子，具有特异性促内皮细胞有丝分裂作用，作用于血管内皮细胞，防止内皮细胞凋亡，强烈诱导新生血管形成和增加血管通透性，在多种组织缺血性疾病中均可以促进侧支循环的建立，增加缺血组织血流量，改善缺血组织的功能。同时还可能具有多重神经保护作用。
在不同海拔高度做慢性缺氧大鼠脑梗死动物模型，用免疫组化的方法在脑梗死术后1、3、7、14天检测脑组织的ASPP1、VEGF的表达情况，评估在低压缺氧预处理后脑梗死大鼠的脑储备能力，探讨高原地区缺血性脑血管病脑储备能力的特点。
材料和方法
1、实验动物
甘肃中医学院动物实验中心雌雄各半清洁级健康Wistar大鼠180只，体重在180g-200g，月龄在2-3月，分为西宁组（海拔2200m）、柴达尔组（海拔3500m）、沱沱河组（海拔4500m），每一海拔组随机分配60只大鼠。分别在当地饲养30天，以期达到高原基本习服，参照Zea Longa等[4]描述的线栓法制作右侧大脑中动脉阻塞（MCAO）的局灶性脑缺血模型, 造模后1天、3天、7天、14天后断头处死、手术取脑，置于10℅甲醛液。按照不同时间组每组随机分配15大鼠。
Longa评分法，0分:没有神经功能缺损; 1分:左侧前爪不能完全伸展; 2分:行走时，大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈; 3分:行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒; 4分:不能自发行走，有意识丧失。1-3分为入选实验动物。
2、主要试剂及实验方法
SP-0023 HistostainTM--Plus Kits试剂盒内容
试剂（无色液体）:3℅H2O2去离子水
试剂A（蓝色液体）:封闭用正常山羊血清工作液
试剂B（黄色液体）:生物素化二抗工作液（IgG/Bio） SP—9000:生物素标记山羊抗兔、大鼠和豚鼠IgG
试剂C（黄色液体）:辣根酶标记链酶卵白素工作液（S-A/HRP）
一抗: Rabit Anti-ASPP1(apoptosis stimulating protein of P53 1)、Rabit Anti-HIF1 alpha、Rabit Anti-VEGF
二氨基联苯胺染色试剂盒（DAB Staining Kit）为25倍浓缩液，包装规格为25倍A显色液（棕色）1ml，25倍B显色液1ml。以去离子水920μl，加入B显色液40μl混匀，再加入40μl A显色液，混匀后即可使用。
以上试剂皆购于北京莱博生物实验材料研究所
HE染色按照常规染色步骤进行，免疫組化实验步骤严格按照说明书进行。
3、免疫組化结果判定
ASPP1蛋白定位于细胞浆和细胞核，以细胞浆和（或）细胞核呈棕黄色为阳性细胞， VEGF蛋白主要定位于细胞浆，胞浆含有棕黄色颗粒的细胞计为阳性细胞。染色强度以多数呈现的染色特征为标准，参照Mattern法, 按染色深浅分为4级:未见染色为0分(-),染成浅黄色即轻度染色为1分(+),染成棕黄色即中度染色为2分(＋＋),染成棕褐色即重度染色为3分(＋＋＋); 每张切片镜下随机选择10个高倍视野（10×40），每个视野计数100个细胞，计算各个视野中阳性细胞的平均百分比作为该切片的阳性细胞百分比:未见染色为0分(-),染色细胞< 25%为1分(+),染色细胞>25%且<50%为2分(＋＋),染色细胞>50%为3分(＋＋＋)。两项的乘积即为免疫组化评分。
4、统计学处理  
免疫組化评分以均数士标准差( ±ｓ)记录。采用统计软件SPSS11.5进行统计学分析。多组均数间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA ),当方差分析有显著性差异时，进一步用LSD-t检验作两两比较，检验水准取a=0.05，当P<0.05时有显著性差异。
结果
1、 ASPP1在不同海拔高度和造模后不同时间点脑梗死大鼠脑组织中的表达









讨论
1、ASPP1在脑梗死大鼠脑组织中的表达及意义 低氧是调控细胞生存和凋亡的重要调节因素。一方面，适度低氧可以对抗细胞凋亡；另一方面，严重低氧能诱导细胞凋亡。低氧抗细胞凋亡。低氧在适度情况下能诱导自我保护机制，使机体能耐受更严重的刺激。适度的低氧刺激分为两种形式，一种是短时程反复刺激，即低氧预适应（hypoxia preconditioning），二是长时程温和的、间歇性低氧刺激，即间歇性低氧。这两种形式都能有效地对抗细胞凋亡。严重低氧诱导细胞凋亡。

本研究显示ASPP1免疫组化结果在大鼠脑梗死后1和3天之间没有显著性差异，其它时间组均有显著性差异；海拔3500m组和2200m、4500m组之间具有显著性差异。说明适度的低氧刺激激发脑的代谢储备能力，可以对抗细胞凋亡。海拔2200m组和4500m组之间不具有显著性差异，说明在高海拔或是特高海拔地区，由于严重低氧的存在，诱导了细胞凋亡，ASPP1的表达增高。

2  VEGF在脑梗死大鼠脑组织中的表达及意义 VEGF是高度特异的血管内皮细胞有丝分裂剂，通过刺激缺氧组织建立有效侧支循环或恢复内皮细胞完整性，发挥“自身搭桥”作用；VEGF 还能促进血管内皮再生、抑制血管内膜增厚、防止再狭窄及恢复内皮依赖性功能，从而减轻脑缺血损伤。有研究表明VEGF有神经营养作用，它们在新血管生成之前对神经系统起着直接保护作用，这有助于延长细胞的存活时间，直到新血管生成。Sondell等研究发现VEGF能刺激轴突生长和改善神经细胞的存活。 Issa等也指出在病理状态下，VEGF 对中枢神经系统有保护作用。VEGF 参与缺血脑损伤的病理发展和修复过程。

本研究显示VEGF在不同海拔高度和造模后不同时间点脑梗死大鼠脑组织中的免疫组化结果，除去脑梗死后3天和14天之间没有显著性差异，其余组间均具有显著性差异。说明VEGF在不同海拔高度状态下的不同程度的缺氧预处理表达程度不同，海拔高度越高，缺氧程度越严重，表达程度越高；反之，则越低。经过缺氧预处理的脑梗死大鼠，在脑梗死后不同时间点VEGF表达程度不同，脑梗死后1、3、7天逐渐增加，至7天达到最高，14天仍然处于较高水平。

缺氧预处理(hypoxia preconditioning，HP)是指适度的缺氧可触发机体的内源性保护机制，使机体对接下来发生的严重缺氧或其它致死性应激产生防御和抵抗作用。HP是多因素、多机制参与的保护过程。在中度海拔和高海拔地区适度低压缺氧可以对抗细胞凋亡，在特高海拔和极高海拔地区能诱导细胞凋亡。适度低压缺氧预处理可以减少脑梗死后细胞凋亡的发生，提高能脑储备能力；在不同海拔高度低压缺氧预处理可以提高机体VEGF的表达水平，增强脑储备能力，尤其是脑结构储备和脑代谢储备能力，对抗脑梗死后的脑损伤，促进脑神经结构和功能的恢复。